在超低溫冰箱中存儲(chǔ)生物樣品的**佳實(shí)踐

雖然許多研究人員經(jīng)常使用超低溫冰箱，但我們很少有人知道我們可以采取的所有措施來真正保護(hù)我們的樣品。2012年5月，哈佛腦組織資源中心（一家著名的腦庫(kù)）的超低溫冰箱失敗，損壞了世界上**大的自閉癥大腦樣本集合的三分之一。冷凍室外部溫控器讀數(shù)為-80°C，但內(nèi)部溫度實(shí)際上是冰箱溫度。樣本的丟失嚴(yán)重阻礙了自閉癥的研究，強(qiáng)調(diào)了實(shí)施低溫保存**佳實(shí)踐的重要性。在本版本的Bench Tips中，我們建議您在超低溫冰箱中保存樣品的四個(gè)技巧。

建立冗余

大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)有帶報(bào)警系統(tǒng)的冷凍柜，但無法安裝獨(dú)立的溫度監(jiān)控器和適當(dāng)?shù)膫溆孟到y(tǒng)。McLean冰箱是哈佛大腦組織資源中心的24個(gè)冰箱之一，受到兩個(gè)獨(dú)立報(bào)警系統(tǒng)的保護(hù)。工作人員每天檢查兩次外部恒溫器，以確保組織樣本保持在-80°C。然而，隨著溫度的升高，外部恒溫器繼續(xù)讀取-79°C，因此無法觸發(fā)警報(bào)。

如果實(shí)驗(yàn)室有獨(dú)立的溫度監(jiān)控器連接到警報(bào)器，通過一個(gè)單獨(dú)的端口進(jìn)入冷凍室，樣品可能已經(jīng)不再使用。另一個(gè)好的投資是CO2或液氮備用系統(tǒng)。如果冷凍機(jī)出現(xiàn)故障，系統(tǒng)可以將氣體釋放到冷凍室，為您提供額外的時(shí)間將樣品轉(zhuǎn)移到功能單元。確保始終有一個(gè)容量相似的備用冷凍柜來容納轉(zhuǎn)移的樣品。

防止冷凍室燒傷

冷凍是一種復(fù)雜的現(xiàn)象，尚未完全理解。各種冰凍溫度產(chǎn)生不同種類的冰晶，其形成速度不同。在-80℃的環(huán)境中，形成穩(wěn)定的六方晶體，但是進(jìn)入和離開這種穩(wěn)定的冷凍狀態(tài)是一個(gè)微妙的過程。通常，細(xì)胞越大，慢慢冷卻就越重要。即使對(duì)于更耐受的可滲透細(xì)胞，在環(huán)境溫度下每分鐘1℃的冷卻速率也是**佳的。預(yù)先添加冷凍保護(hù)添加劑（如DMSO或甘油）可以在冷凍過程中保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)濃度增加和冰晶形成的影響。DMSO在細(xì)胞內(nèi)冷凍之前促進(jìn)細(xì)胞更大程度的脫水，而甘油是一種毒性較小的替代品。DMSO和甘油通常以??5％**10％（v / v）的濃度使用，但它們很少一起使用，除了植物細(xì)胞的研究。使用已知細(xì)胞類型的**高濃度來耐受和消毒試劑級(jí)溶液。相反，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，應(yīng)盡快使用37°C水浴進(jìn)行解凍。

為細(xì)胞類型定制條件

細(xì)胞類型，細(xì)胞活力，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞的生理狀態(tài)只是在制備冷凍保存細(xì)胞之前評(píng)估的一些因素。在植物細(xì)胞中，**好從對(duì)數(shù)晚期收獲細(xì)胞并使用兩步冷卻過程 - 將細(xì)胞保持在-30℃一段時(shí)間，然后在-80℃冷凍。微生物細(xì)胞，特別是在充氣條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌和酵母，比未經(jīng)充氣的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)冷卻和冷凍的有害影響的抵抗力。冷凍真菌孢子時(shí)，確保在冷凍前不發(fā)芽。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)確定培養(yǎng)物冷凍前后的活力和估計(jì)恢復(fù)。計(jì)數(shù)的比較將表明您的技術(shù)成功。通常，**初存在的細(xì)胞數(shù)量越多，

積極組織

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立-80°C存儲(chǔ)協(xié)議非常重要。為所有未標(biāo)記的樣本制定一個(gè)無例外的拋出規(guī)則。實(shí)驗(yàn)室成員只有在將樣品編入中心位置后才能進(jìn)入冷凍室，必須定期備份。

特別注意標(biāo)簽。藍(lán)色**性標(biāo)記傾向于褪色并在冰箱中變得難以辨認(rèn)。直接寫在乙醇保存樣品上的信息幾乎不可避免地在聚丙烯管上消失。許多粘貼標(biāo)簽在超低點(diǎn)下降; 在進(jìn)行大規(guī)模購(gòu)買之前測(cè)試幾種不同的類型。特別注意螺旋環(huán)頂部的墊圈，這些墊圈會(huì)隨著時(shí)間的推移而破裂。每年對(duì)所有儲(chǔ)存材料進(jìn)行除霜和清潔可使記錄保持平直，并可能使實(shí)驗(yàn)室無法購(gòu)買另一臺(tái)冷凍機(jī)進(jìn)行溢流。此外，請(qǐng)記住，大多數(shù)研究人員存儲(chǔ)在-80°C的習(xí)慣。請(qǐng)記住，溫度越低，消耗的能量越多。某些類型的樣品 - 微生物培養(yǎng)物，酵母和真菌 - 在-70°C儲(chǔ)存中很好。

作為建議的**后一句話，能源消耗過多的跡象 - 如冷凝，設(shè)備前面的水泄漏，過熱的房間和響亮的聲音 - 表明冰箱有問題。留意并定期進(jìn)行維護(hù); 這些步驟應(yīng)該保證您的冰柜安全，您的樣品可以在未來幾年內(nèi)保持活力。